二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识解读

[好文分享：www.ii77.com]

[本文来自：www.ii77.com]

汝 昆

主任医师，研究员。擅长血液病理的疑难病例诊断，今朝致力于人工智能在血液病的精准诊断方面的研究。承担国度级和省市级课题及人才项目11项；国表里期刊揭橥学术论文100余篇；参编7部血液学专著；主导和介入制订11项血液病诊疗中国专家共识/指南；中国承认委医学专委会委员、国度药监局医疗工具分类手艺..委员、中国生物医学工程协会人工智能分会血液病辅助决议尺度化学组组长、人工智能医疗工具尺度化手艺归口单元单子专家组专家、中国老年医学会病理学分会副会长、中国抗癌协会血液肿瘤专委会常委兼血液病理工作组组长、天津市医学会病理学分会主任委员、天津医师协会磨练医师分会副会长等；担当美国临床病理杂志、北美医学杂志、中华病理学杂志、中华血液学杂志、临床与实验病理学杂志、白血病淋巴瘤等杂志编委。

任何一项新的生物手艺之所以可以在临床快速成长，都和临床需求慎密相关。跟着血液肿瘤发病机制研究的络续深入，基因突变在疾病发生成长过程中的感化逐渐被证实，个中具有明确临床意义的突变基因已经被纳入了国际分类或诊疗指南中[2,3]。而NGS凭借高通量、高活络度、可定量和成本低的优势，在基因突变检测方面有着弗成替代的感化。是以，正如《共识》所说起，NGS在血液肿瘤的诊断分型、预后剖断、治疗指导、微小残留病（MRD）监测和克隆演变方面都具有主要的应用价格。

1.血液肿瘤诊断分型：从最新WHO分类中新增的以基因突变定名的亚型能够看出，基因突变检测已经成为血液肿瘤诊断的需要手段。急性髓系白血病伴重现性遗传学非常、遗传易感性髓系肿瘤、骨髓增殖性肿瘤、骨髓增生非常综合征伴环形铁粒幼细胞、毛细胞白血病和淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球卵白血症中存在一些特异性的突变基因，这些突变基因的检测是其诊断的首要尺度之一。在另外血液肿瘤的诊断中，突变基因的检测同样能够起到辅助诊断的感化[1]。 

2.预后剖断：跟着基因组学研究的深入，越来越多的突变基因被纳入到血液肿瘤的预后分层系统。并且大多数血液肿瘤患者往往会同时发生多种基因突变，单一基因突变的检测已不足以精准地指导临床预后，多种基因突变的结合剖析已成为近年的研究热点，所以NGS的高通量特点优势显著。

3.治疗指导：血液肿瘤是一类异质性很强的肿瘤，对患者遗传配景的周全剖析是实现个别化治疗的前提。经由突变基因的检测，能够选择响应的靶向药物，同时对传统药物的敏感性进行评估。

4.微小残留病（MRD）监测：血液肿瘤MRD监测的分子指标首要包罗融合基因、非常表达基因及基因突变。今朝，流式细胞学（FCM）和RQ-PCR依然是MRD主流的监测方式，RQ-PCR活络度较FCM高，可达10-5，但每次回响仅能检测一个基因片段，适用于明确的分子非常，首要作为融合基因、常见类型好比NPM1突变以及WT1表达等指标的MRD监测手段。比拟之下，NGS可以同时检测多个突变基因、突变位点及突变类型，对复发时不具有先前的突变或显现新突变的患者，NGS多靶点意义尤为凸起，并且NGS经由提高检测深度可进一步提高活络度。 

5.克隆演变：基因突变是肿瘤细胞克隆演变的根蒂和前提，在克隆演变的过程中，血液肿瘤会发生基因突变负荷的改变、新突变基因的显现或许原有突变基因的丢失，这种复杂的基因改变是传统的PCR或Sanger测序无法检测到的，而NGS可一次检测到所有的基因变异，有效识别亚克隆。经由NGS剖析克隆演变，有助于认识血液肿瘤的分子发病机制、耐药机制，展望疾病的成长，并为治疗供应新的靶点[4-7]。

《共识》对NGS检测的基因列表设计、整体实验流程、生物信息剖析及最终的申报规范息争读进行了完整的介绍。

1.若何设计基因检测列表？首先，应充裕考虑基因列表的临床适用性。因为实验室检测最终要办事于临床诊疗，是以设计基因列表要从临床诊疗的实际需求出发，由血液和实验室专家配合制订；其次，检测基因的筛选应考虑临床意义的主要性；检测基因的数量应在知足临床需求的根蒂上，综合样本数量、检测..以及检测成本达到最优化的设计；检测的基因种类也应需跟着临床诊疗的研究进展按期更新；最后，选择检测区域时，对于引物/探针笼盖不到的主要区域，或许大片段插入/缺失、碱基不屈衡（一连碱基、高GC片段）等NGS结果差的基因片段，例如，FLT3-ITD、CEBPA、NPM1等基因，需要经由PCR和Sanger测序等方式增补检测，避免显现假阴性。

2.实验流程中有哪些注重事项？（1）骨髓、外周血或组织样本均可检测，然则脱钙样品不克用于NGS检测，已染色的组织标本不介绍进行NGS检测。无论是何种样本，首先都要确保样本中含有充沛数量的肿瘤细胞。一样情形下，建议NGS检测的组织样本中肿瘤细胞含量达到20%以上[8]，不然应富集肿瘤细胞或增加测序深度，避免假阴性究竟。此外，为了正确区分胚系突变与体细胞突变，建议同时送检患者正常组织作为胚系突变对照。（2）DNA提取后，要对DNA进行浓度、纯度和完整性的评估，尤其是石蜡组织样本；同时设立明确的及格样本尺度，平日A260/280 应介于1.6-2.2，A260/230 应介于1.6-3.0，DNA浓度建议不少于20ng/ul。（3）文库制备时，多标本同时测序应明确分歧的检测标本和分子标签的对应关系。各实验室应依据测序..及测序策略竖立最低的及格文库量，文库浓渡过高或过低会导致测序数据量削减文库片段。文库片段小会导致测序数据量少，片段大导致测序质量下降及拼接错误率增加。

3.若何进行生物信息学剖析？对NGS发生的原始数据需要经由质控剖析、数据过滤、序列比对、突变位点的识别和注释以及突变位点的筛选一系列生物信息剖析。《共识》对每个步伐的生物信息处理进行了详尽的介绍，并列举了剖析过程中常用到的软件和参考数据库，实验室需要提前选择合适的软件，并设定好响应的剖析参数和质控指标，包管数据剖析的正确性。突变位点筛选环节固然大部门实验室已实现主动化，但需要时还应进行人工查对，尽或者清扫假阳性和假阴性位点。筛选时首要考虑变异位点的测序深度、reads数、变异等位基因频率、碱基比对证量值等指标，同时参考变异位置、变异类型、功能展望数据库、人群数据库及疾病数据库等。

此外，为了正确识别肿瘤的体细胞突变，建议同时检测患者的正常组织（口腔黏膜或毛囊等）作为胚系突变对照。若无法实现，实验室可参考变异等位基因频率、dbSNP、人群数据库、实验室自建数据库等，尽或者区分体细胞突变和胚系突变。

4.究竟申报息争读：若何把经由生物信息学剖析后的检测数据完整正确地转换为医学信息，是NGS临床应用面临的挑战之一。《共识》从申报的根基信息、突变位点的描述和分级申报，以及若何进行申报解读等方面进行了仔细阐述。

实验室应尽或者的将检测究竟以周全、客观、简明、易懂的体式呈现给临床大夫及患者，为此应注重：1）申报内容的解读需由具备临床医学（尤其是血液学）及分子遗传学专业配景的人员配合介入，以知足临床应用的特别要求；2）在对突变位点具体解读之前，建议凭据患者情形进行总结性的解说，以轻易临床大夫从申报中敏捷获取要害信息；对于多次送检的患者，尤其需要注重连系以往检测究竟和临床信息进行综合剖析；3）介绍凭据突变位点的临床意义进行分级申报，分为具有明确临床意义的突变、具有潜在临床意义的突变、临床意义未明的突变。新发现的良性或或者良性变异不建议列在申报中。突变位点的描述信息应尽或者周全，如物理坐标、变异频率、测序深度等；4）申报中应描述突变位点在临床诊断、预后评估和治疗中的意义，并供应数据库或参考文献等支撑依据，同时应稀奇注重数据库及参考文献的适用性，避免检测究竟的过度解读；5）阴性究竟不完全代表不存在突变，应注重清扫因为活络度或检测区域局限性等手艺原因所导致的假阴性；6）跟着研究的进展，某些基因的临床意义等信息或者会更新，若有特别需求时可考虑增补申报内容[9]。

完美的质量掌握系统是包管检测究竟实时正确的前提。总体来讲，NGS的质量掌握和另外分子生物学检测相似。首先应知足《分子病理诊断实验室扶植指南（试行）》、《医疗机构临床基因扩增磨练实验室工作导则》等分子生物学检测行业的通用要求。同时鉴于NGS方式的复杂性，剖析前、剖析中、剖析后的各个环节都应设立严厉的专业化的室内质控尺度，并对有或者影响到检测究竟正确性的各个身分进行评估和划定，包罗人员、仪器、试剂、情况、检测方式等。同时还应按期列入室间质评项目或实验室间比对。

NGS自身的优势决意了其普遍的应用前景，但同时手艺的复杂性也决意了应用中会面临各类挑战。相信跟着科学手艺的进一步成长，相关治理监视机制的日臻完美，NGS的临床实践将会越来越规范化，也将在疾病的临床诊疗中施展越来越主要的感化。

参考文献略

注：本文起原于《临床实验室》2020年第5期“肿瘤及陪伴诊断”专题