「生殖科普」辅酶Q10联合维生素E对高龄女性卵巢功能及IVF结局的影响

年龄与女性生育力密切相关，女性35岁以后生育力明显下降，表现为卵巢储备功能下降，妊娠率降低，而流产率升高，围产期母儿不良结局增加。随着中国“二孩”政策的开放，具有生育要求的高龄女性群体增加，同时也为生殖医学带来更多挑战，其中大部分高龄女性卵巢储备低下，卵巢对于促性腺激素（Gn）药物反应性差以及自身卵母细胞质量差是影响辅助生殖技术成功率的瓶颈因素。除了针对卵巢功能低下的高龄女性设计个体化促排卵方案外，使用有效的助孕药物也是目前生殖医学领域的研究热点。 辅酶Q10作为公认的线粒体营养剂，临床已广泛应用于充血性心力衰竭、帕金森氏病、弱精子症、黄斑变性等疾病的辅助治疗中，但在高龄女性卵巢功能减退患者中的治疗有待探讨。本研究以卵巢功能低下的高龄女性为研究对象，体外受精－胚胎移植（IVF－ET）前联合使用 辅酶Q10与维生素Ｅ，评价其对于卵巢功能及IVF结局的影响，以期为高龄女性改善卵巢功能提供有效的助孕策略。

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一、研究对象
２０１６年３月至２０１７年３月于武汉大学人民医院生殖医学中心行IVF－ET的年龄超过35岁的卵巢储备功能低下患者。目前世界对于卵巢储备功能低下尚无统一的诊断标准，本研究采用目前公认和常用的纳入标准：
（１）连续２个周期ｂＦＳＨ水平超过１０Ｕ／Ｌ；

（２）自然周期月经第２天至第５天..Ｂ超提示双侧卵巢窦状卵泡数≤５个；

（３）抗苗勒管激素（ＡＭＨ）＜１．１ｎｇ／ｍｌ；

（４）基础雌二醇≥３１１．１ｐｍｏｌ／Ｌ。

满足以上２条及以上可认为卵巢功能低下。排除生殖道畸形、染色体异常、子宫内膜损伤及子宫腺肌症、卵巢器质性疾病和卵巢良性肿瘤、内分泌因素如多囊卵巢综合征、甲状腺功能异常、高泌乳素血症等患者。共纳入符合标准的１５２个周期。本研究获得武汉大学人民医院伦理..批准。所有患者均签订知情同意书。

二、分组
本研究按各年龄段构成比进行分层随机抽样，利用随机数字表简单随机化分组，在IVF周期前进行不同的预处理。其中４６个周期入选对照组（Ａ组），不给予辅助用药；５３个周期为Ｂ组，给予维生素Ｅ，用法为IVF前每日口服３００ｍｇ，共３个月；５３个周期为Ｃ组，联合给予 辅酶Q10和维生素Ｅ，用法为IVF前每日口服３０ｍｇ 辅酶Q10和３００ｍｇ维生素Ｅ，共３个月。进一步以４０岁为年龄分界点分为两个亚组。35～４０岁患者纳入组１：Ａ１（ｎ＝２１）／Ｂ１（ｎ＝２５）／Ｃ１（ｎ＝２５）；４０岁以上患者纳入组２：Ａ１（ｎ＝２５）／Ｂ１（ｎ＝２８）／Ｃ１（ｎ＝２８）。

三、研究方法
１．窦卵泡数测定：月经来潮第２～５天经..超声检测子宫及附件情况，测量直径２～１０ｍｍ的窦卵泡数目（ＡＦＣ）。

２．激素指标测定：月经来潮第２～５天检测基础性激素水平，采用化学发光免疫分析测定血清ＦＳＨ、ＬＨ、Ｅ２和ＡＭＨ水平。促排卵周期测量Ｅ２峰值水平。

３．促排卵治疗及冻融胚胎移植（ＦET）：采用高孕激素状态下促排卵（ＰＰＯＳ）方案。在月经第３～５日起开始口服安宫黄体酮片，每日４～１０ｍｇ，同时肌肉注射ＨＭＧ（１５０～３００Ｕ／ｄ，根据卵泡发育的情况调整ＨＭＧ和ＭＰＡ用量。当３个卵泡直径超过１８ｍｍ时，注射ＨＣＧ１００００Ｕ诱发排卵，３４～３６ｈ后取卵。受精后培养至Ｄ３，评估胚胎质量，包含６个以上均匀一致的卵裂球且细胞碎片小于２０％的胚胎定义为优质胚胎。ＰＰＯＳ方案要求行全胚冷冻。ＦET内膜准备和黄体支持：月经周期规律，有自然排卵者采用自然周期；月经周期规律或无自然排卵者用人工周期。自然周期者于月经周期Ｄ１０～Ｄ１２时行Ｂ超监测子宫内膜及卵泡情况，结合血或尿ＬＨ值确定排卵日，ＬＨ峰值出现第３天行冻胚移植。人工周期者从月经周期第３天起每日服用补佳乐２～６ｍｇ，第１１天行Ｂ超及性激素检查，根据结果调整补佳乐剂量，当内膜厚度达≥８ｍｍ，且具有典型的“三线”内膜时决定内膜转化时机，具体用药及调整参考本中心常规方案。

根据患者年龄、内膜准备情况等决定移植胚胎数，一般不超过３枚。移植后行黄体支持，移植后１２～１４ｄ检测血ＨＣＧ＞１０Ｕ／Ｌ者２周后Ｂ超下见孕囊确定为临床妊娠，临床妊娠率定义为移植后３０ｄ临床妊娠的周期数／总周期数×１００％。

四、观测指标及判定标准
比较不同预处理方案的患者基本信息，包括平均年龄、年龄构成、ＢＭＩ、不孕年限、基础性激素水平（ｂＦＳＨ、ｂＥ２和ｂＬＨ）、ＡＭＨ、ＡＦＣ、受精方式和人工／自然周期数。对于各年龄亚组患者，比较卵巢储备指标（包括ＡＦＣ、ｂＦＳＨ和ｂＥ２水平），同时比较各亚组卵巢反应性和IVF结局指标，包括Ｇｎ总量、Ｇｎ天数、ＨＣＧ日子宫内膜厚度、促排卵Ｅ２峰值水平、获卵数、优胚数及临床妊娠率。

五、统计分析
采用ＳＰＳＳ１６．０统计软件包对数据进行统计分析。计数资料用率表示，组间率比较采用卡方检验；计量资料比较采用ｔ检验。Ｐ＜０．０５示差异有统计学意义。

一、患者基本信息比较
Ａ、Ｂ、Ｃ三组患者平均年龄、年龄构成、ＢＭＩ、不孕年限、基础性激素水平（ｂＦＳＨ、ｂＥ２和ｂＬＨ）、ＡＭＨ、ＡＦＣ、受精方式和人工／自然周期数相比较，均无统计学差异（Ｐ＞０．０５）（表１）。

二、 辅酶Q10联合维生素Ｅ对不同年龄患者卵巢储备功能的影响

进一步按照患者年龄分为35～４０岁和＞４０岁两组，比较两个年龄组患者接受 辅酶Q10联合维生素Ｅ辅助治疗的卵巢储备功能情况。
１．35～４０岁年龄组：Ｃ１组ＡＦＣ显著高于Ａ１和Ｂ１组，且Ｃ１组ｂＦＳＨ、ｂＥ２水平显著低于Ａ１和Ｂ１组（Ｐ＜０．０５）；Ｂ１组ｂＦＳＨ水平显著低于Ａ１组（Ｐ＜０．０５），但ＡＦＣ与之无统计差异（Ｐ＞０．０５）（表２）。

这表明，单独使用维生素Ｅ可降低35～４０岁女性ｂＦＳＨ水平，但不能提高ＡＦＣ，而 辅酶Q10联合维生素Ｅ可加强对35～４０岁女性卵巢的抗氧化保护作用，提高卵巢储备功能，相比于单独使用维生素Ｅ对于卵巢保护作用效果更好。

２．＞４０岁年龄组：Ｃ２组ＡＦＣ显著高于Ａ２和Ｂ２组，且Ｃ２组ｂＦＳＨ、ｂＥ２水平显著低于Ａ２和Ｂ２组（Ｐ＜０．０５）；Ｂ２组ｂＦＳＨ、ｂＥ２和ＡＦＣ与Ａ２组相比均无统计差异（Ｐ＞０．０５）（表３）。

这表明， 辅酶Q10联合维生素Ｅ可加强对４０岁以上女性卵巢的抗氧化保护作用，提高卵巢储备功能，相比于单独使用维生素Ｅ对于卵巢保护作用效果更好。
 
三、 辅酶Q10联合维生素Ｅ对于不同年龄患者卵巢反应性和IVF结局的影响
１．35～４０岁年龄组：无论与Ａ１组或Ｂ１组相较，Ｃ１组Ｇｎ总量、Ｇｎ天数、促排卵Ｅ２峰值水平、ＨＣＧ日子宫内膜厚度及获卵数均有统计学差异（Ｐ＜０．０５），而优胚数及临床妊娠率均无统计学差异（Ｐ＞０．０５）；与Ａ１组相比较，Ｂ１组无论Ｇｎ总量、Ｇｎ天数、ＨＣＧ日子宫内膜厚度、促排卵Ｅ２峰值水平、获卵数、优胚数及临床妊娠率均无统计学差异（Ｐ＞０．０５）（表４）。

这表明， 辅酶Q10联合维生素Ｅ可协同提高35～４０岁女性的卵巢反应性，对IVF结局的影响虽无统计学差异，但尚有一定的改善趋势。２．＞４０岁年龄组：无论与Ａ２组或Ｂ２组相比较，Ｃ２组Ｇｎ总量、Ｇｎ天数、促排卵Ｅ２峰值水平、ＨＣＧ日子宫内膜厚度及获卵数均有统计学差异（Ｐ＜０．０５），而优胚数及临床妊娠率均无统计学差异（Ｐ＞０．０５）；与Ａ２组相比较，Ｂ２组无论Ｇｎ总量、Ｇｎ天数、ＨＣＧ日子宫内膜厚度、促排卵Ｅ２峰值水平、获卵数、优胚数及临床妊娠率均无统计学差异（Ｐ＞０．０５）（表５）。

这表明， 辅酶Q10联合维生素Ｅ可加强提高４０岁以上女性的卵巢反应性，对IVF结局的影响虽无统计学差异，但尚有一定的改善趋势。讨论卵母细胞的发育过程相对复杂，且需要良好的线粒体功能以提供足够的三磷酸腺苷帮助完成减数分裂过程。而线粒体功能的下降可导致ＡＴＰ水平下降，继而出现卵母细胞发育阻滞，非整倍体率增加以及受精率下降。随着女性年龄增长，线粒体ＤＮＡ突变几率增加，而相关修复酶类体系活性降低，导致线粒体ＤＮＡ复制时错误几率增加。与此同时，高龄女性体内容易发生一类４９７７对碱基的错误删除，几乎占整个线粒体ＤＮＡ三分之一，也是高龄女性受精率和妊娠率低下的一个重要原因。线粒体尤其对于氧化应激损伤敏感，当线粒体遭受活性氧（ＲＯＳ）攻击时，自身启动能量永动循环作为防御机制，却同时进一步导致ＲＯＳ产生增加。恶性循环下，能量依赖的减数分裂、受精和囊胚形成过程都会受到影响，导致胚胎和卵母细胞质量下降，受精率和妊娠率降低。外源性应用抗氧化剂可改善线粒体功能，有利于改善IVF结局。Ｂｅｄａｉｗｙ等研究表明，卵泡液中抗氧化剂水平升高有利于IVF结局。 辅酶Q10存在于线粒体内膜上，在生物体中能提供或移去氧，与线粒体复合物ＩＩＩ稳定性密切相关。一方面，生物氧化过程中，于线粒体呼吸链上起到将电子从复合物Ｉ和复合物ＩＩ传递至复合物ＩＩＩ的关键作用。同时通过传递质子，维持线粒体膜电位，促进ＡＴＰ合成酶产生ＡＴＰ。另一方面， 辅酶Q10是有效的抗氧化剂，已被证实可阻止脂质及蛋白质的过氧化，清除体内和细胞的自由基。若 辅酶Q10缺乏，会造成上述过程异常，自由基聚集，氧化应激损伤加重。而人体中能量依赖及消耗较大的组织器官如骨骼肌、内分泌腺体和神经组织更易受到影响。 辅酶Q10因其抗氧化作用广泛，已应用于临床充血性心力衰竭、帕金森氏病、弱精子症、黄斑变性等临床辅助治疗中，而这些疾病均与线粒体不同程度功能障碍相关。

随着年龄增长，女性患者体内 辅酶Q10水平逐渐下降。Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ等［研究表明，每天补充１５０ｍｇ 辅酶Q10可提高IVF女性周期的获卵数及ＭＩＩ期卵母细胞数。一项来自加拿大的随机双盲安慰剂对照的ＲＣＴ研究表明，平均年龄35～４３岁女性不孕患者２个月内连续每日摄入６００ｍｇ 辅酶Q10，临床妊娠率提高至３３％（对照组为２６．７％），极体活检和比较基因组杂交方法结果表明非整倍体率降低至４６．５％（对照组为６２．８％）。虽终无统计学差异，推测可能由于研究终点前退出人员造成样本量未达到预期检验效能所致，但研究结果趋势表明， 辅酶Q10对于高龄女性的卵母细胞线粒体具有一定的保护作用。在一项前瞻性随机对照实验中，ＥｌＲｅｆａｅｅｙ等研究结果表明，多囊卵巢综合征患者口服 辅酶Q10（１８０ｍｇ／ｄ，ｑｄ，从周期第２天直至ＨＣＧ日），联合克罗米酚促排卵治疗，该联合用药方法显著提高克罗米酚抵抗的ＰＣＯＳ患者卵巢反应性，包括直径大于１４ｍｍ及大于１８ｍｍ卵泡数和子宫内膜厚度指标均较对照组提高，临床妊娠率亦相应提高。

本研究结果发现，单独使用维生素Ｅ对于高龄女性卵巢储备的改善作用不明显，虽可降低35～４０岁女性ｂＦＳＨ水平，但不能提高ＡＦＣ；而对于４０岁以上高龄女性，ｂＦＳＨ水平和ＡＦＣ均无改变。ＡＦＣ是指早卵泡期..超声下测量直径２～１０ｍｍ的窦卵泡数目，是反映卵巢储备的直接指标。血ｂＦＳＨ水平在临床上也常用于评价卵巢功能，但存在波动性较大，反映卵巢功能具延时性的局限。当联合使用 辅酶Q10和维生素Ｅ时，无论是35～４０岁女性，或者４０岁以上女性，均可有效加强对高龄女性卵巢的抗氧化保护作用，改善卵巢储备，提高卵巢反应性，相比于单独使用维生素Ｅ对于卵巢保护作用效果更佳。体内抗氧化物质通常并非单独发挥清除自由基的作用，更多通过联合作用或者协同作用加强抗氧化效能。 辅酶Q10通过转换氧化还原性结构，与维生素Ｅ共同起到抗氧化作用。白宁宁等研究发现，通过探讨水溶性 辅酶Q10联合维生索Ｅ在老龄小鼠和Ｄ－半乳糖模型动物的抗氧化作用效果，发现其抗氧化作用优于单独运用维生素Ｅ组，对体内自由基清除作用明显，有利于恢复老龄机体自由基产生和清除的代谢平衡。本研究结果表明，联合用药组对于IVF结局指标虽无统计学差异，尚有改善趋势，有待进一步扩大研究样本量的随机对照研究深入探索。

目前，机制探索上，国内外已有相关体内外实验进行 辅酶Q10与卵巢功能相关性的研究。Ｔｕｒｉ等通过高效液相质谱检测卵泡液中 辅酶Q10含量，发现成熟卵母细胞的卵泡液 辅酶Q10含量显著高于异常卵母细胞，Ｉ～ＩＩ级胚胎的原卵泡液中 辅酶Q10含量显著高于ＩＩＩ～ＩＶ级胚胎，可见卵泡液中 辅酶Q10含量与卵母细胞成熟度和胚胎质量密切相关。Ａｂｄｅｌ－Ｋｈａｌｅｋ等研究发现，兔卵母细胞体外成熟培养（ＩＶＭ）基质中添加０．４ｍｇ／ｍｌ 辅酶Q10后，受精率和囊胚形成率较对照组显著提高。Ｂｕｒｓｔｅｉｎ等［２６］以８个月老年小鼠为动物模型组，促排卵治疗前分别给予长达１８周 辅酶Q10、ａ－硫辛酸及白藜芦醇三种抗氧化剂，结果表明，与１０周低龄小鼠相比，仅 辅酶Q10可明显提高老年小鼠的卵泡数、线粒体ＤＮＡ拷贝数，降低ＲＯＳ水平，有效改善卵巢储备和线粒体功能。ｚｃａｎ等在顺铂类物质诱导形成ＳＤ大鼠卵巢氧化应激损伤模型的基础上，连续给予大鼠１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ 辅酶Q10灌胃１４天，发现血ＡＭＨ水平显著提高，ＡＭＨ表达阳性的卵泡数增加、窦卵泡数增加、闭锁卵泡数减少，表明 辅酶Q10对于氧化应激损伤下的卵巢组织具有一定保护作用。Ｂｅｎ－Ｍｅｉｒ等研究表明，人类和大鼠卵巢组织中与 辅酶Q10产生相关的关键酶类基因为Ｐｄｓｓ２和Ｃｏｑ６，随着年龄增加，两类酶类基因表达下降，而高龄引起的卵巢功能下降可通过补充 辅酶Q10改善，提高卵母细胞的质与量。

综上所述，相比于单独使用维生素Ｅ，无论是35～４０岁或４０岁以上女性患者， 辅酶Q10联合维生素Ｅ可协同加强对高龄女性卵巢的抗氧化保护作用，改善卵巢储备，提高卵巢反应性。虽然 辅酶Q10联合维生素Ｅ对IVF结局指标无统计学差异，尚有一定的改善趋势，有待进一步通过扩大样本量的随机对照研究进行深入探索。