周末文摘丨栀子及其复方栀子豉汤长期用药潜在安全风险研究及建议

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目的 ：通过栀子苷、栀子水提物和栀子豉汤给大鼠反复用药 6 个月的安全性研究，为含栀子药物的临床合理用药和风险控制提供依据。方法 ：SD 大鼠随机分为对照组和三个给药组（栀子苷组、栀子水提物组和栀子豉汤组），三个给药组的剂量均以栀子苷计相同（50 mg/kg）。各组每日灌胃给药 1 次，连续 6 个月。于给药后 1、3、6 个月和给药 6 个月后停药 1 个月分别处死一批动物，采集血、尿、脏器等进行血液学、血液生化学、尿常规、凝血、脏器病理等分析。结果 ：三个给药组雌、雄动物在 1 个月和 3 个月结束时，除了肝、肾颜色稍深染以外，未见其他明显异常反应，检查的各脏器组织均未见与药物相关的病理损伤。给药 6 个月后， 肉眼可见肝脏和肾脏颜色深染 ；显微镜下可见肝细胞和肾小管细胞中有呈棕色的药物颗粒沉积于胞质，颗粒明显处可见组织细胞损伤。肝脏可见肝细胞轻度变性、胆管增生和炎性细胞浸润。肾脏可见肾小管细胞肿胀、细胞脱落等。栀子苷组与栀子水提物组的肝肾病理改变相近，栀子豉汤组相对较轻。肝肾功能生化分析只有个别指标的改变有统计学显著性意义，但总体上仍在正常值范围内波动。停药 1 个月后，脏器内的药物沉积情况明显减轻，肝肾组织形态学与对照组无明显差异。结论 ：栀子及其复方长期用药（≥ 6 个月）可造成药物在肝脏和肾脏蓄积，并造成潜在的肝肾毒性，与栀子苷有关。建议《中国药典》栀子的【含量测定】项下对栀子苷制定最高限量 ；【用法与用量】项下增加“不宜长期用药”。另外，建议将栀子从《既是食品又是药品的物品名单》中移除，以避免作为食品长期服用而造成的风险。

栀子是茜草科植物栀子的果实，临床上应用广泛，属于卫生部门颁布的第一批药食两用资源。栀子的主要化学成分包括环烯醚萜苷类栀子苷、栀子苷酸， 二萜类西红花苷和藏红花酸、黄酮类栀子素、有机酸酯类绿原酸及栀子苷的水解产物京尼平^[1]。栀子的药理作用主要包括保肝利胆，对急慢性肝损伤^[2，3]、胆汁淤积性肝损伤^[4]、非酒精性脂肪肝炎^[5]、肝纤维化及肝癌^[6]均有明显的治疗作用， 此外还有抗炎、治疗神经退行性疾病、糖尿病、心脑血管疾病的作用^[7]。栀子苷是栀子的主要活性成分^[8]，在某些情况下也可能造成一定的肝损伤^[9]。前期研究表明，大鼠长时间灌胃给予栀子苷（栀子苷100 mg/kg，连续用药 6 个月）可引起一定程度的肝肾损伤。由于栀子苷仅为栀子的成分之一，临床并不使用栀子苷，而是使用栀子或含栀子的复方，因此有必要研究栀子以及含栀子的复方是否会产生与栀子苷类似的潜在毒性，为临床用药提供安全性信息。

本研究采用栀子苷、栀子水提物和含栀子复方平行对比进行大鼠灌胃给药 6个月加停药 1 个月的长期毒性实验，重点考察对肝肾的潜在毒性。栀子水提物和复方均以栀子苷调整为同等剂量。复方采用栀子豉汤。该方由栀子和淡豆豉组成， 出自《伤寒论》，是清宣郁热除烦的经典方。淡豆豉有健胃助消化、抗痴呆、抗氧化、抗自由基和保护心血管的作用^[10]。现代研究表明，栀子豉汤具有清热除烦作用， 临床用来治疗抑郁症 ^[10]。抑郁症是一种慢性疾病，在治疗过程中需要长期用药以保证治疗效果。因此，本研究以栀子豉汤为复方代表进行大鼠长期用药的潜在毒性观察。

1.1 供试品

栀子苷（批号 ：S140807），HPLC法测定含量为 97.122%，购于北京赛白草科技有限公司。使用时现用现配，用纯净水配制。栀子（批号 ：140113008），HPLC 法测定原药材中栀子苷的含量为5.675%，购于北京仟草中药饮片有限公司。采用常规水煎法制备栀子水提物（北京市卫生局临床药学研究所制备），浓缩为棕黑色膏状，栀子苷含量为 8.7258%， 用纯净水稀释后灌胃用。淡豆豉（批号 ： 140227001），购于北京仟草中药饮片有限公司。栀子豉汤制备 ：采用栀子∶淡豆豉 =1∶1 混合，采用水煎法制备为棕黑色膏状。栀子豉汤中栀子苷的含量为4.0365%。

1.2 动物

健康 SPF 级 SD 大鼠 160 只， 雌雄各半，6~7 周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 ：SCXK（ 京）2012-0001， 合格证号  ：11400700099088。动物饲养于中国中医科学院医学实验动物中心动物房，采用人工光照，屏障系统，12 小时明暗交替， 换气次数不少于 15 次 /h，室内温度控制在 20~26℃，湿度为 40%~70%，自由设施饮水，每笼 5 只。所有大鼠检疫适应 5 天后进行实验。本实验由中国中医科学院中药研究所动物伦理..批准， 依照实验动物应用伦理准则进行实验，实验的相关步骤均遵照此规定。

1.3 仪器

动 物 天 平（Sartorius）， 全 自 动生 化 分 析 仪（Toshiba）， 尿 液 分 析仪（Simens Clinitek）， 血凝仪（ 普利生 ），全自动血液分析 仪（Simens），电解质分析仪（Medica），光学倒置 显微镜（Olympus）， 全自动脱水机（Shandon），石蜡包埋机（Microm），石 蜡 切 片 机（Thermo）， 全 自 动 染色 机（Microm）， 高 速 冷 冻 离 心 机（sigma）等。

2.1 分组及给药

将 SD 大鼠随机分成 4 组 ：对照组、栀子苷（geniposide）50 mg/kg 组、栀子水提物（AEFG）573 mg 生药 /kg 组、栀子豉汤（GSPD）1.239 g 生药 /kg 组。除对照组外，其他三组的栀子苷剂量相等（50 mg/kg）。 每组 40 只动物， 雌雄各半。对照组灌胃给予纯净水。其他组分别给予不同的药物，每日给药 1 次，连续给药，最长周期为 6 个月。分别于给药 1、3、6 个月结束时，各组分别处死雌性和雄性各 5 只动物，收集各种生物样本。各组其余动物于停药恢复 1 个月后再处死。各时间点的生物样本和检测分析按照以下“2.2 观察及检测指标”中描述的方法进行。

2.2 观察及检测指标

每周称取 1 次未禁食体重和摄食量， 于给药前后及恢复期观察大鼠的一般状态（动物外观、行为活动、神态步态、尿液粪便等）。

给药 1、3、6 个月和恢复期结束时， 用大鼠代谢笼收集尿液，进行尿液常规检查（尿量、pH 值、比重、葡萄糖、尿蛋白、胆红素、尿胆原、酮体、潜血、亚硝酸盐、白细胞）。各时间点抽取血液，进行血液学检测（血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、网织红细胞计数、红细胞相关指标、血小板相关指标等）；凝血指标检测（凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间）；血液生化学检测（天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、γ- 谷氨酰基转移酶、总胆固醇、总胆红素、5' - 核苷酸、肌酐、尿素氮等），电解质检测（钠、钾、氯）。解剖并摘取脏器称重，计算脏器指数（心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑、胸腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫）。此外，还摘取了胃、大小肠、垂体、气管食管、甲状腺、胰腺、唾液腺、前列腺、膀胱、脊髓、胸骨等脏器或组织，进行病理学检查。

2.3 统计学分析

体重、摄食量、血液生化学、脏器指数、尿量、血液学、凝血指标均以平均值 ± 标准差表示，用单因素方差统计 ；尿常规分析应用 Kruskal-Wallis 和 Mann- Whitney' s U 检验方法。比较各给药组与对照组之间的差异，当 P<0.05 时认为差异有显著性。

3.1 栀子苷、AEFG、GSPD 对动物一般状况无明显影响

对照组和栀子苷、AEFG、GSPD各给药组动物在实验期间均未见死亡，一般状况好，外观、行为活动、神态步态和粪便均未见异常。三个给药组的动物体重和摄食量与对照组比较均无明显差异（数据未列示），提示药物对体重增长和食量无明显影响。栀子苷组尿液颜色加深呈棕色和黄绿色 ；AEFG 和 GSPD 组均呈绿色和墨绿色。

3.2 长期用药后可造成肝脏和肾脏药物蓄积并导致肝肾损伤

给药 3 个月后，栀子苷组、AEFG 组和 GSPD 组的肝脏和肾脏颜色均加深， 呈现绿染现象，给药 6 个月后更明显， 肝肾均呈墨绿色，对照组和 AEFG 组的肝脏颜色见图 1。停药 1 个月后，肝、肾绿染情况明显好转，颜色基本恢复正常。

图1　大鼠灌胃给予AEFG 后肝脏中由于药物成分蓄积而呈现为墨绿色（肾脏情况类似， 栀子苷和GSPD组与AEFG 组类似）

A ：对照组       B ：AEFG 组

给药 1 个月后雌性大鼠 AEFG 组的肝指数和肾指数显著升高。给药 3 个月后雄性大鼠栀子苷组、AEFG 组和 GSPD 组的肝指数均显著高于对照组，其他各给药时间点的脏器指数未见异常改变。恢复期结束后雄性大鼠各组之间的脾指数和肺指数有显著差异，而雌性大鼠栀子苷的肾指数显著降低。除上述变化之外，各给药组的心脏、肺、脑、胸腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫器官指数与对照组无显著差异。图 2 显示的是不同时间点有统计学显著性的肝肾指数结果。

图2　栀子苷、AEFG 和GSPD 对大鼠肝脏和肾脏指数的影响。数据表示为Mean±SD，n=5

A ：1 个月雌性肝脏；B ：3 个月雄性肝脏；C ：1 个月雌性肾脏；D ：恢复期雌性肾脏

**P<0.01，***P<0.001，与对照组相比；^#P<0.05，^##P<0.01，与栀子苷组相比；^&P<0.05，^&&P<0.01，与AEFG 组相比

显微镜检查可见，给药 1 个月和 3 个月后，各给药组雌性和雄性动物的肝脏组织与对照组比较无显著异常。给药 6 个月后，栀子苷组、AEFG 和 GSPD 各给药组雌、雄大鼠的肝细胞浆内均可见药物颗粒沉积，弥漫性分布，以中央静脉周围更明显，有的动物伴有轻度至中度胆管增生，其中 AEFG 组胆管增生明显（5 只雄性大鼠中有 3 只达到中度胆管增生）。此外，GSPD 组 1/5 只雄性大鼠的肝组织中可见类肉芽肿，见图 3 和表 1。雌性AEFG 组 3/5 只动物可见肝细胞核固缩， 栀子苷组 1/5 只动物有类似改变，见表 1， 雌性大鼠肝组织异常程度略低于雄性。停药 1 个月后，各给药组肝细胞内药物沉积颗粒明显减少。

表1　给予栀子苷、AEFG 和GSPD 6 个月后雌雄大鼠肝脏和肾脏的异常病理表现的数量（n=5）

栀子苷组、AEFG 和 GSPD 各组给药 1 个月和 3 个月，各组肾脏组织结构与对照组比较无显著异常。但给药 6 个月后各给药组雌、雄大鼠肾组织均可见异常改变，包括肾小管肿胀、上皮细胞脱落、炎性细胞浸润、管腔内见渗出。此外，各给药组雌性和雄性大鼠的肾小管细胞内均可见棕色的药物颗粒沉积，其中，雌性大鼠栀子苷组和AEFG 组各有3/5只大鼠可见较多的颗粒样物质沉积，见图4 和表1。此外，雄性大鼠GSPD 组有1/5 只大鼠肾脏组织可见大量的炎性细胞浸润，见表1，雄性大鼠肾组织异常程度略低于雌性。停药1 个月后，各给药组肾小管细胞内药物沉积颗粒明显减少。图3 和图4 显示的是代表性肝脏和肾脏病理形态变化。

图3　大鼠灌胃给予栀子苷、AEFG 和GSPD 6个月后对肝脏组织形态的影响。

A ：对照组；B ：栀子苷组；C ：AEFG 组；D ：GSPD 组。H&E 染色，比例尺为50μm

图4　大鼠给予栀子苷、AEFG 和GSPD 6 个月后对肾脏组织形态的影响

A ：对照组；B ：栀子苷组；B1 ：B 图中红色矩形的高倍放大图像；C ：AEFG 组；C1 ：C 图中红色矩形的高倍放大图像；D ：GSPD 组。H&E 染色，比例尺为50μm

除肝肾组织外，各给药组的其他脏器或组织心脏、肺、脑、脾脏、胃、大肠、小肠、垂体、气管、食管、甲状腺、胰腺、唾液腺、前列腺、膀胱、脊髓等未见明显病理变化。

3.3 血液生化学结果

栀子苷、AEFG 和 GSPD 给药 1 个月和 3 个月后，各给药组总胆红素（TBiL） 明显降低，与栀子的药效有关。雄性大鼠给药 3 个月后栀子苷组的 γ- 谷氨酰基转移酶（γ-GT）显著升高。除此之外，三个给药组给药 3 个月后其他生化检测结果均未见明显异常。给药 6 个月后，GSPD 组雄性大鼠的 γ-GT 和尿素氮（BUN）较对照组显著升高（P<0.05），见图 5 A 和 B, 但 γ-GT 和 BUN 的 上升幅度有限，TBiL 结果显著降低（图 5 C 和 D，P<0.01）。停药后 1 个月， 各给药组血液生化学指标未见异常。

图5　给予栀子苷、AEFG 和GSPD 6 个月后雌雄大鼠部分血液生化学结果（平均值± 标准差，n=5）

A ：雄性γ-GT ；B ：雄性BUN ；C ：雄性TBiL ；D ：雌性TBiL*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组相比；^#P<0.05，与栀子苷组相比；^&&P<0.01，与AEFG 组相比

3.4 尿液和血液学分析

尿液学分析结果显示，给药 1 个月和 3 个月后，各给药组与对照组相比无显著差异。给药 6 个月后，栀子苷组雄性大鼠的尿液胆红素（BIL）和雌性大鼠的BIL 和尿胆原（URO）与对照组相比有显著增高（P<0.05）。AEFG 组雄性和雌性大鼠的 URO、BIL 和雄性大鼠的亚硝酸盐、雌性大鼠的酮体（KET）与对照组相比有显著增高（P<0.01）。GSPD组的雌雄动物的 BIL、URO 和尿蛋白（PRO）显著增高（P<0.05）。恢复期结束后，各给药组与对照组相比均无显著差异。由于各给药组的尿液受药物的影响而颜色明显加深，因此不能排除尿液中药物颜色对上述尿液指标分析的干扰和影响。

血常规分析结果显示，给药 6 个月后，栀子苷、AEFG、GSPD 组雌性动物网织红细胞比例较对照组显著增高。除此之外，栀子苷、AEFG、GSPD 各给药 1、3、6 个月后雌、雄大鼠虽然有少数血液学指标与对照组比较具有显著差异，但各项血液学指标值均在正常范围波动，不认为有毒理学意义。

4.1 含栀子的药物长期用药可造成蓄积性肝肾损伤，临床不宜长期用药

栀子在中成药中应用广泛，主要用于实热、火毒壅盛、湿热黄疸等，用于这些目的时通常用药时间较短。然而，由于栀子有清热除烦功效，目前栀子在临床上也被用于治疗慢性肝炎、抑郁症和糖尿病等慢性疾病 ^[7,10,11]。临床发现，病人如果服用含有栀子的中成药时间稍长（3 个月左右），可见皮肤深染发绿现象。在本研究中，我们发现栀子苷、AEFG 和含栀子的复方 GSPD 长期用药后，均可见药物成分在肝、肾组织中蓄积，肉眼可见肝肾颜色变深，呈现绿色或墨绿色 ；显微镜下可见肝脏细胞、肾小管细胞胞质中有弥漫性药物颗粒沉积，同时造成一定的肝、肾细胞损伤，其中药物沉积量多的细胞病变更为明显。而血液生化分析显示肝肾功能相关的指标除了 γ-GT 和 BUN 升幅有限的增高外，其他指标并无显著异常。结果提示，常规的血液生化指标检测可能无法准确预测栀子及其复方的肝肾损伤。本实验中 AEFG、GSPD 和栀子苷组均设计为相同的栀子苷剂量，三个给药组具有剂量可比性，以便于客观比较三者的毒性反应。栀子在临床上的日用量为 6~10 g，《中国药典》2015 年版规定栀子中栀子苷的含量不得小于 1.8%^[8]，而市面上栀子中栀子苷的最高含量可达 6%。以栀子苷含量中位水平 4% 计算，大鼠服用栀子苷 50 mg/kg 相当于人（60 kg 体重）服用栀子剂量为 11 g 生药，接近临床剂量。本研究提示，即使是采用栀子的临床剂量， 如果长期用药也可能造成药物蓄积，并造成肝肾毒性。因此，临床上使用含栀子的药物时应注意用药时间不宜过长。

4.2 栀子的肝肾毒性与栀子苷有关

本实验室以往的研究已经报道过栀子苷过高剂量或者长期用药均可造成肝肾毒性，其毒性表现与本研究类似。本研究采用栀子苷、AEFG、GSPD 平行设计，三组的剂量按照栀子苷计均相同（50 mg/kg），三组给药 6 个月后肝脏和肾脏均发生了明显的药物蓄积，同时部分肝肾组织有毒性表现。其中栀子苷组和AEFG 组在肝肾细胞内药物蓄积以及组织损伤上虽有微弱差异，但是基本类似和相近，说明栀子产生的药物蓄积主要是栀子苷引起的，其肝肾毒性可能与栀子苷有关，这个与以往的报道相类似 ^[9]。GSPD 组的肝肾损伤作用与另外两组相比程度明显较低，提示栀子复方中的配伍应用可能有助于减轻栀子苷的肝肾毒性作用，这与前期研究结论相类似 ^[12]。

4.3 《中国药典》关于栀子的质量标准应增加栀子苷最高限量和不宜长期用药的提示

本研究显示，大鼠给予栀子 苷、AEFG、GSPD 1 个月和 3 个月肝肾组织损伤尚不明显，而长期用药 6 个月出现了肝肾毒性。结果提示 : 在一定的剂量下将给药时间限定在一定范围内可能相对安全。由于栀子药材中栀子苷含量范围差异较大，我们从市场购买的栀子的栀子苷含量接近  6%，相当于《中国药典》2015年版规定的栀子苷限量标准（1.8%）的3 倍余。前期研究我们发现栀子苷过高剂量即便是短期使用时也可造成肝脏和肾脏毒性。因此，根据本研究，我们建议《中国药典》中栀子的【含量测定】项下，不仅对栀子苷的最低含量做出规定，还需要对栀子苷的最高含量制定限量标准，以降低可能摄入过量的栀子苷而导致肝肾毒性的风险。另外，为了避免长期用药产生毒性，应在【用法与用量】项下增加“不宜长期用药”。

4.4 建议将栀子从《既是食品又是药品的物品名单》中移除

除了在药品中使用外，栀子被列于《既是食品又是药品的物品名单》上，因此其在食品和保健食品中的应用越来越广泛。据统计，含有栀子的保健品有 70 余个，涉及保健功能有 18 种，包括对化学性肝损伤有辅助保护作用、免疫调节、抗疲劳、祛痤疮、改善睡眠、辅助降血脂等。作为食品和保健品应用时，长期食用的可能性较大。由于人们通常认为食品与保健品具有较高的安全性，因此服用剂量和使用时间随意性较大。鉴于栀子的蓄积性相对比较明显，长期用药具有潜在风险，建议将栀子从《既是食品又是药品的物品名单》中去除。