施军平：跟踪非酒精性脂肪性肝病的临床试验-无创指标评价

1  临床试验无创替代终点的意义

全因死亡率是评价NAFLD药物临床试验最理想的临床终点。肝脏相关死亡率是全因死亡率的一个组成部分，与腹腔感染、上消化道出血、肝性脑病、肝癌和肝衰竭的发生密切相关。由于NASH患者达到临床结局（全因死亡率或肝脏相关死亡率）需要漫长的时间，将全因死亡率或肝脏相关死亡率作为临床终点随访时间过长，使其很难用于药物研发，作为未患肝硬化NASH患者临床试验的主要终点不切实际。相对而言，在已伴发肝硬化的NASH患者中，更易发生失代偿事件或死亡，将全因死亡率或肝脏相关死亡率作为临床试验终点的可操作性更强。因此，为早期NASH患者设计临床试验面临巨大挑战。考虑到NASH未来的不良结局和肝脏负担，开发相关治疗药物也刻不容缓，因此确定能在合理时间内达到的可靠替代终点就显得非常重要。基于某些组织病理学特征与疾病进展密切相关，肝脏组织学现在被认为是追踪NAFLD进展的最佳替代终点。但因其侵入性、患者可接受性差、采样可变性以及并发症风险影响患者的依从性和研究的可操作性，已成为NAFLD治疗药物开发的一个瓶颈。近年来，开始被血清学指标和定量影像技术等非侵入评价方法引入到NAFLD临床试验中，并作为现有临床试验的次要或探索性终点来进行评价。

2  目前评价NAFLD临床试验的主要无创指标

2.1  基于血清学的评价指标

▲ 血清肝酶学

主要指标包括ALT、AST、GGT等。虽然血清ALT水平持续升高与疾病进展风险增加有关，但这些患者中仅47%有NASH。基于目前广泛接受的界限值，37.5%的ALT水平正常患者有NASH或者进展性肝纤维化，以血清ALT水平诊断NASH和进展性肝纤维化的敏感度仅为62%和46%。PIVENS和TONIC研究证实了成人和儿童NASH患者血清ALT水平的下降与肝脏组炎症改善相一致，基于肝酶学检测具有客观性、可测量性和简便等优点，目前依旧是各期临床试验所采用的一个重要的无创评估指标。

▲ 血清细胞角蛋白（CK）

18CK-18是肝脏中间丝蛋白。当受到脂肪堆积影响而受损的肝细胞发生凋亡时，细胞凋亡蛋白酶裂解的CK-18片段被释放入血液，导致血清中CK-18水平升高。因这种肝细胞凋亡的激活途径为NASH所特有，而在肝细胞脂肪变性中并不存在，血浆CK-18检测有助于对NAFLD患者进行风险分层，具有简易性、易普及等特点。早期研究显示CK-18可以作为鉴别成人和儿童NASH和NAFL的标志物，诊断NASH的敏感度和特异度为83%和71%，受试者工作特征曲线下面积（AUC）可达0.82，在儿童中诊断NASH的AUC为0.993。一项Meta分析研究显示CK-18诊断NASH的特异度和敏感度分别为：CK-18(M30),75%和77%; CK-18(M65),71%和77%。CK-18和其他标志物联用可进一步提高诊断价值，但是需要在更大的队列中证实。

CK-18作为一项新型诊断NASH的血清标志物，也被作为NASH临床试验中一个“附加”的血清无创替代指标，在成人和儿童NASH患者的2期临床试验中显示其与肝组织学以及ALT的改善相关度较好。

但如果要将CK-18确立为用于NASH临床试验的“合格”无创生物标志物，除了要核实其在特定人群中的性能特征，尚需一些额外研究：如该标志物预测临床终点，以及检测的可重复性，在随后多中心临床试验中CK-18随时间推移及不同中心间的测量差异等均需要进一步评估。 

▲ 无创评分系统

评估肝脂肪变较常用的有：脂肪肝指数(FLI)和肝脂肪变指数(hepatic steatosis index, HSI)。FLI通过对13个变量进行多因素分析，最终将BMI、腰围、甘油三酯及GGT纳入公式，其诊断准确度为84%，95%可信区间(95%CI)为0.81~0.87。HSI则是将ALT/AST、BMI、性别及糖尿病纳入公式，其诊断准确度为81.2%，95%CI为0.801~0.824。因其简便、易获得而适用于大样本人群的流行病学筛查研究，近来也有临床试验将其作为脂肪变程度改善的一项评价指标。NASH评估模型NASHTest纳入了年龄、性别、身高、体质量以及血清三酰甘油、胆固醇、α2巨球蛋白、载脂蛋白A1、触珠蛋白、GGT、ALT、AST和TBil水平等13个变量，诊断NASH的AUC在0.75~0.79，其中对非NASH的诊断率可达86%，该模型适用于排除NASH，避免不必要的肝穿刺。最常用的肝纤维化评分模型主要是NAFLD纤维化评分(NFS)，主要纳入年龄、受损空腹血糖/糖尿病、BMI、血小板、白蛋白和AST/ALT等。NASHTest和NFS是临床试验中较为常用且可靠的评价NASH及肝纤维化程度改善的无创指标，与肝组织学改善有较好的相关性。

此外，反映肝脏炎症和纤维化的一些细胞因子如CRP、IL-6/TNFα与新型血清标志物如成纤维细胞生长因子19、血清胆汁酸等在临床试验中被作为主要的临床替代血清指标，但在临床实践中是否可以单独作为疗效评价标准还需要更多的研究来证实。基于多数NAFLD伴有糖脂代谢异常，且心脑血管事件是NAFLD患者的主要死亡原因，一个“理想”药物是在治疗NASH同时能够改善其糖脂水平，而胰岛素抵抗指数和血脂谱是公认的心脑血管事件的替代指标，因此也需要将其纳入评价NAFLD合并代谢异常疗效的常见血清指标。

2.2  基于影像学的无创指标

▲ FibroScan定量测定

基于瞬时弹性成像(TE)为基础的FibroScan通过无创定量测定可以同时评价肝脂肪变及纤维化程度，受控衰减参数（CAP）诊断轻、中、重度脂肪变的AUC分别为0.85、0.88和0.87,肝硬度值（LSM）诊断肝纤维化分级≥F2、≥F3及≥F4的AUC分别为0.84、0.93及0.95，适用于NAFLD患者的无创诊断及定期随访。在GR-MD-02治疗NASH伴桥接纤维化的2期临床研究中，重度肝脂肪变(CAP值显著增高)、明显的肝脏炎症(血清氨基酸转移酶＞5倍正常值上限)、肝淤积和胆汁淤积等都可高估LSM。LSM评估纤维化程度的可靠性不如CAP评估脂肪肝程度。 

▲ CT扫描

CT是根据肝/脾CT比值(L/S)来量化肝脂肪含量，CT值＜1.0时可诊断为脂肪性肝病，肝脂肪变＞30%，其诊断的特异度为100%。尽管在治疗糖尿病的临床研究中发现肝/脾CT比值能很好的评估肝脂肪含量的变化，但由于有辐射的风险，且敏感度并不优于超声定量，也无法评估NASH及纤维化程度，因此并不推荐用于临床试验中人群的筛查、诊断、疗效评估以及预后。

▲ 磁共振定量检测

用于测量肝组织脂肪含量采用的是磁共振波谱(MRS)，通过直接测量来自脂质子和水质子的信号强度来估计质子密度脂肪分数（PDFF），敏感度和特异度分别为80.0%~910％和80.2%~87.0％，MRS-PDFF还可用于评估NAFLD患者疗效。具有简单、可重复、无创等特点。缺点是选择的感兴趣区域较小，不能反映全肝，不适用于不均质脂肪变。磁共振弹性成像（MRE)是定量诊断NAFLD肝纤维化程度的新型非创伤性成像法，其评估有无肝纤维化的最佳阈值为4.15 kPa，诊断的AUC为0.954，敏感度和特异度分别为85%和92.9%，不受肝脂肪变的影响，适合极度肥胖的患者。在确诊NAFLD患者进展期纤维化（3期或4期）AUC为0.924，最佳阈值为3.63 kPa时，敏感度为86%，特异度为91%。GR-MD-02治疗NASH伴2期临床试验中显示MRE变异系数仅为11%，明显优于LSM。MRE也适用于儿童肝纤维化的诊断和评估。在一项西他列汀治疗NAFLD的随机、双盲、安慰剂对照临床试验中，分别采用MRS-PDFF和MRE来评估脂肪肝和肝纤维化的改善程度，结果显示西他列汀并不优于安慰剂，进一步证实了MRS-PDFF和MRE作为无创的磁共振定量检测方法可用于临床试验中的疗效评价，并可作为临床试验次要或探索性终点的最主要无创替代指标。面临的问题是：研究成本高，检测时间长，并非所有试验基地都能提供该检测方法。

3  小结

NAFLD被认为是医药领域尚未涉及的最后一个疾病，在未来10年中将是新药研发领域的主要产出和竞争之地，但在临床试验的设计和具体实施过程中同样也面临着前所未有的挑战。在选择无创的替代评价指标时，早期临床试验尝试提供概念验证的证据，或者确定药物的合适剂量，可采用肝脏血清转氨酶或者其他生物学标志物作为终点。在2b期和3期试验中，可以考虑使用与肝脏相关结局联系密切的替代终点如NFS、MRS-PDFF和MRE等。与此同时，基于症状和功能状态的终点如生活质量相关评分、疲劳量表等无创指标的评价也具有重要的临床意义。