【饮食】母体摄入三氯蔗糖会改变子代肠道菌群，并加剧成年期肝脂肪变性

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英文问题：Maternal sucralose intake alters gut microbiota of offspring and exacerbates hepatic steatosis in adulthood

中文问题：母体摄入三氯蔗糖会改变子代肠道菌群，并加剧成年期肝脂肪变性

揭橥期刊：《Gut Microbes》      IF：7.823

揭橥时间：2020/3/31

通信作者：王邦茂、曹海龙

通信单元单子：天津医科大学总病院

将C57BL/6孕鼠随机分为MS组（怀胎期和哺乳期摄入MS）和母系对照组（MC组）。断奶后，所有的幼仔在8周龄之前都以尺度饮食喂养，然后用高脂饮食（HFD）喂养4周。对3周龄的幼鼠进行肠道发育、粘膜屏障功能和肠道菌群的检测。此外，在第12周评估肝脂肪变性的严重水平、血清生化、脂质代谢和肠道微生物构成等。

图1a 实验流程图

在本研究中，幼鼠的性别比例和总产仔数在MS组和MC组之间没有显著差别，且两组均未发现灭亡。除MS组子代在2~4周龄时体重显着高于MC组外，其余8周龄测准时间点两组子代体重根基一致。但在HFD 15天后，MS组子代体重显着高于MC组。是以，增补MS可稍微增加断奶期子代体重，显著加重HFD幼鼠的体重（图1b）。

在小鼠出生后第三周之前，胃肠道的发育首要受母体营养的影响。本文研究了三氯蔗糖对3周龄幼鼠肠道发育和肠道屏障完整性的影响。MS组3周龄幼鼠的绒毛长度和隐窝深度显着小于MC组（图1c-d）。与MC组对照，MS组Ki67阳性增殖细胞数削减（图2a）。同时，高碘酸希夫（PAS）阳性细胞（杯状细胞）数量也削减（图2b）。MUC2是杯状细胞最主要的产品之一，与黏液层的形成亲切相关。凭据MUC2阳性细胞的数量和mRNA的表达，与MC组比拟，MUC2的表达量下调（图2c-d）。慎密保持卵白包罗ZO-1、Claudin-1、Claudin-3和Occludin被认为是决意肠道屏障完整性的最主要身分。PCR数据显露，MS组Claudin-1、Claudin-3、ZO-1表达显着降低，Occludin表达与MS组相似（图3a）。此外，免疫荧光也提醒MS组中ZO-1卵白表达下降（图3b）。免疫球卵白A（IgA）在肠道免疫屏障功能中起着要害感化，能够按捺病原体的粘附。IgA免疫荧鲜明示，MS可显著降低IgA在小肠的表达水平（图3c-d），提醒MS可按捺幼鼠早期肠道发育，损坏肠道屏障的完整性。

经由H&E染色发现，两组幼鼠小肠和结肠没有显着的炎症回响（图1c）。进一步评估促炎细胞因子的水平，包罗IL-1β，IFN-γ和结肠组织TNF-α。发现MS 组中这些促炎细胞因子mRNA 表达水平旦显高于MC组（图2e）。究竟表明，摄入MS可引起子代肠道轻度炎症，伤害肠道屏障功能。

图1b-d 母鼠摄入三氯蔗糖按捺了3周龄幼鼠的肠道发育

图2 母鼠摄入三氯蔗糖骚动幼鼠肠道增殖和分化，并诱发3周龄幼鼠结肠轻度炎症

图3 母鼠摄入三氯蔗糖损坏幼鼠结肠的慎密保持，并使3周龄幼鼠小肠IgA削减

经由16s rRNA测序对3周龄子代肠道菌群构成和构造进行剖析。Venn图显露，MC组共356个OTU，MS组共281个OTU，两组配合拥有268个OTU（图4a）。剖析两组的微生物群落构造发现，门水平优势物种离别是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。MS组疣微菌门和变形菌门的相对品貌跟着拟杆菌门的削减而升高。在属水平，MS组与MC组之间存在显著差别的属首要有：Akkermansia、Alistipes、Barnesiella、Blautia、棒状杆菌属（Corynebacterium）、Paraprevotella、Robinsoniella、Saccharibacteria_genera_inc-ertaesedis、链球菌属（Streptococcus）。与MC比拟，MS组 Akkermansia、Blautia、棒状杆菌属和Robinsoniella显著增加；同时，Alistipes、Barnesiella、Paraprevotella、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis和链球菌属削减（图4b）。

经由Shannon和Simpson多样性指数评估3周龄幼鼠的微生物alpha多样性。MS显著降低了alpha多样性（图4c）。经由主坐标（PCoA）剖析和Adonis磨练对非加权 UniFrac 距离进行较量，较量两组样本间的差别。究竟表明，MS对3周龄幼鼠的微生物构成有显著影响（图4d）。

图4 母体摄入三氯蔗糖改变了3周龄幼鼠肠道微生物构成

经由LEFSe差别剖析两组细菌在门、纲、目、科、属水平上的品貌差别（图5a）。差别物种品貌热图如图5b所示。个中MS组抗炎相关的Alistipes相对品貌较低。Parabacteroides（一种能调节宿主代谢、减轻肥胖和代谢功能障碍的菌属），在MS组中显著降低。而与肥胖和代谢杂乱高度相关的Blautia在MS组中显著升高。此外，在MS组中，疣微菌门的Akkermansia（一种降解黏液的菌）相对品貌增加，这或者是因为3周龄子代黏膜屏障功能的损坏和炎症回响的增加。与MS组肠道轻度炎症增加相一致，埃希氏杆菌属（Escherichia）/志贺氏杆菌（Shigella）和Anaerostipes在炎症性肠病和代谢杂乱中更为雄厚的菌，在MS组中增加。链球菌和瘤胃球菌在MS组中削减，以往的研究中发现，这两种菌与炎症呈负相关。此外， MS 组产丁酸盐细菌Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）和Clostridium XlVa显著削减。这些究竟表明，在孕期和哺乳期摄入MS可骚动子代的肠道微生物构成。

图5 母鼠摄入三氯蔗糖改变了3周龄幼鼠体内要害细菌和SCFAs的发生

碳水化合物细菌发酵可发生醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐等肠道SCFAs。已有研究报道肠道屏障功能与肠道SCFAs浓度呈正相关。在本研究中，MS组的丁酸盐产量显着低于MC组，乙酸和丙酸盐产量也有下降的趋势（图5c）。上述发现以及上述微生物构成的转变提醒，发生SCFAs的细菌数量的削减和丁酸盐产量的下降或者与MS摄入导致肠道发育的按捺和肠道屏障的损坏有关。

越来越多的研究表明，早期肠道微生物失衡和慢性炎症或者与成年期的不良后果有关。本文研究了早期摄入MS是否会增加成年期肝脂肪变性的风险。总的来说，MS组肝脏颜色为淡..，而MC组肝脏颜色为暗红色（图6a）。MS组肝脏及腹部脂肪组织重量较MC组显着增加（图6b）。与MC组比拟，MS 组丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶显著增加 。此外，MS组血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平旦显升高（图6c）。

H&E染色证实，两组12周龄幼鼠均有显着的脂肪肝。MS组脂肪变性较严重，炎性细胞大量浸润，显现部门片状坏死。同时，MS组NAFLD活性评分(NAS)也显著高于MC组（图6d）。MS组肝脏的炎性细胞因子IL- 6和TNF-α等也升高（图6e）。

与MC组比拟，MS组Fasn、Acaca等脂肪酸合成基因表达水平升高，胆汁酸合成限制酶Cyp7a1基因被按捺，肝脏中调节胆汁酸合成的要害基因shp显著上调（图6f）。这些基因表达的改变提醒了MS干扰脂肪酸和胆汁酸的生物合成和代谢。

图6 母体摄入三氯蔗糖会加重12周龄幼鼠HFD诱导的肝脂肪变性

本文重点研究了HFD 4周后，MS组和MC组肠道菌群转变。MS组共336个OTU, MC组共285个OTU，两组配合拥有269个OTU（图7a）。与HFD前比拟，两组中厚壁菌门和变形杆菌门的相对品貌均升高，而拟杆菌门的相对品貌均降低。然而HFD 9周后，MS组变形菌门的品貌比MC组下降得更显着（图7b）。

两组间Shannon和Simpson多样性指数（alpha多样性）无显著差别（图7c）。在beta多样性方面，Adonis剖析显露两组之间存在显著差别（图7d）。基于未加权UniFrac距离的3周龄和12周龄子代的PCoA剖析显露，HFD的确部门稀释了MS驱动的肠道菌群的差别（图7e）。总之，本文研究究竟表明，HFD严重加剧了子女肠道菌群的失调。然而，即使在HFD 4周后，MS组的肠道菌群与MC组仍有部门差别。

图7 母体摄入三氯蔗糖加重12周龄幼鼠肠道发育不良

有报道称，丁酸盐可激活G卵白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPCRs)，包罗在肠上皮细胞和脂肪细胞上表达的GPR41、GPR43和GPR109A。这些GPCRs的激活似乎能够经由多种机制缓解NAFLD的进展。经由免疫组织化学方式检测3周龄子代结肠中GPR41、GPR43和GPR109A的表达发现，在MS组和MC组中，GPR41、GPR43和GPR109A均在结肠组织中表达。然而，MS组结肠中GPR43的表达显着低于MC组，并伴有产丁酸盐细菌和丁酸盐的削减（图8a）。Real-time-PCR数据也显露，3周龄子代结肠组织中GPR43的相对表达量较MC组下降（图8b）。

与对照组比拟，丁酸盐和丁酸梭菌上清液刺激HCT116细胞后，GPR43 mRNA水等分别上调2.2倍和2.8倍，GPR109A mRNA水等分别上调2.9倍和2.1倍，但GPR41 mRNA表达无显着转变。同时，丁酸梭菌上清液和丁酸盐离别使TNF-α的表达下降26.3%和36.1%。此外，经由RNA干扰手艺研究了丁酸梭菌的抗炎功能是否依靠于GPR43。静默GPR43按捺了丁酸梭菌介导的TNF-α 表达量下调。在HCT8细胞中也显现了雷同的究竟（图8c-g）。这些究竟表明，丁酸梭菌经由激活GPR43具有抗炎感化。

图8 丁酸梭菌经由激活GPR43降低炎性细胞因子的发生

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